Rsshttp://www.52yaoshan.cn 2010-8-7 6:52:13 抗癌药膳 收藏本页
《国中药杂志》卷2期2010年1月蟾蜕抗肿瘤及增强免疫效应研究
目的：研究一种新发现的蟾蜍药用部位——蟾蜕在小鼠体内的抗肿瘤及增强免疫效应的功能。方法：检测S180肉瘤、 H22肝癌实体瘤、lewis肺癌荷瘤小鼠服用蟾蜕以后是肿瘤变化，观察蟾蜕延长HCA肝腹水小鼠寿命的效应，采用MTT法检测lewis肺癌荷瘤小鼠服用蟾蜕以后的T淋巴细胞转化率和NK细胞活性变化，同时考察蟾蜕的服用是否对小鼠有明显毒性。结果：服用蟾蜕以后S180肉瘤 H22 肝癌实体瘤 lewis肺癌荷瘤小鼠肿瘤有明显缩小，lewis肺癌荷瘤小鼠T淋巴细胞转化率和NK细胞杀伤性均有明显上升，大剂量服用蟾蜕对小鼠无明显毒副作用。
结论：提示蟾蜕在动物体内具有明显的抗肿瘤效果和增强免疫效应，是一种安全的可用于抗肿瘤治疗的药用动物新资源。
[关键词] 蟾蜕 肿瘤 免疫
蟾蜍，俗称癞蛤蟆，是一种极有价值的经济动物，既可药用又可食用。目前由于滥捕滥杀和农药广泛使用等因素。蟾蜍的资源已大为减少，从而影响了其药用价值的进一步开发。近年来有人发现，蟾蜍在其生长发育过程中可定期蜕下完整的角质衣膜，于蛇蜕皮有一定相似之处，因之将其蜕下的衣膜称为蟾蜕或蟾衣。但蟾蜍蜕皮后往往即刻将其吞吃，一般不留痕迹，除非被人发现并将其截留。经观察和考证，该现象从未被古今本草文献收载，因此将蟾蜕确认为是蟾蜍的一个新的药用部位。蟾蜕一经发现，民间就有人将其用于一些疾病的治疗，并取得一定效果。蟾蜕的药用，不需要杀死蟾蜍，可以有效的保护这一有益资源，因此逐渐被人们重视。为评估这一新资源药用价值，用蟾蜕对实验小鼠进行了抗肿瘤和增强免疫效应的功能测定，以期为蟾蜕的进一步利用提供参考资料。
1 材料
1.1 药材 蟾蜕干粉，由江苏海门康平蟾蜕研究所提供，其原动物经上海中医药大学生药学教研室周秀佳教授鉴定，确认为是中华大蟾蜍 bufo bufo gargar-zans Cantor。取上述适量干粉样品，加少量聚氧乙烯脱水山梨醇单油酸脂（吐温-80）助溶，再逐渐加入0.9% NaCl 溶液至所需量。环磷酸铵（CTX,上海华联制药集团公司）丝裂霉素（MMC，海门制药厂）云芝多糖胶囊（上海中西药业股份有限公司）。
1.2 动物 C57 BL/6 小鼠，体重（19±1）g,合格证号：沪动合证字第107号；昆明种小鼠。体重（19±1）g,合格证号：沪动合证字第105号；6周龄，雌雄各半，清洁级，上海中国科学院动物中心提供。
1.3 瘤株 小鼠S180肉瘤 H22肝癌, lewis肺癌瘤株,HCA肝腹水癌瘤株均由上海医药工业研究院药理室提供。
2 方法
2.1 造摸 取生长旺盛的H22肝癌实体瘤、S180肉瘤模型、Lewis肺癌小鼠，无菌条件下取出肿瘤，以匀浆法制备成1x107个/ml细胞悬液，H22肝癌。S180肉瘤组每只小鼠（昆明鼠）右腋皮下接种0.2ml/只；lewis肺癌组每只小鼠（C57 BL/6）右足趾皮下接种0.05ml/只；制备成实体瘤荷瘤小鼠模型。取生成旺盛的HCA肝腹水癌模型小鼠，无菌条件下抽取腹水，稀释制成备1x107个/ml细胞悬液，各组每只小鼠（昆明鼠）腹腔接种0.2ml/只，制备成腹水型荷瘤小鼠模型。
2.2 蟾蜕对小鼠S180肉瘤、H22肝癌、肺癌的抑制实验 动物造模次日开始给药，随机分组，按高、中、低3个剂量（8,4,2g•kg-1），每灌胃给药1次（每只剂量0.5ml），对照组给以相应的生理盐水，连续10d。环磷酰胺组给以0.03 g•kg-1，连续7d。10d后处死各组动物，剖取肿瘤称重。按下列公式计算肿瘤抑制率。
肿瘤抑制率=（对照组平均瘤重—给药组平均瘤重）/对照组平均瘤重x100%
2.3 蟾蜕对小鼠HCA肝腹水癌的抑制实验 动物造模次日开始给药，随机分组，按高、中、低3个剂量（8,4,2g•kg-1），每灌胃给药1次（每只剂量0.5ml），连续10d。阳性对照组给以丝裂霉素2m g•kg-1，连续7d。对照组给以相应的生理盐水。连续观察3d，计数动物存活情况。
生命延长率-（给药平均生存时间/对照组平均生存时间—1）x100%
2.4 NK 细胞活性检测 lewis肺癌荷瘤小鼠实验给药前，处死后无菌条件下去小鼠脾脏，用100目筛网制成单个脾细胞悬液，用含10%灭活下牛血清的EPMI1640培养液调节细胞浓度为1x107个/ml，作为效应细胞。靶细胞去L929体外培养细胞，常规培养后以培养液调整细胞浓度为1.5 x 105个/ml，取96孔培养板分别加入效应细胞和靶细胞，另单独设效应细胞和靶细胞孔为对照，于37℃5%CO2培养4h后加入DMSO 100μL/孔，37℃孵育30min测各孔A（450mm），按下式计算NK细胞毒活性。
NK细胞毒活性=[靶细胞组A—（实验组A—效应细胞A）]/靶细胞组Ax100%
2.5 淋巴细胞转化实验 lewis 肺癌荷小鼠造模给药同前，处死后无菌条件下取小鼠脾脏，处死后无菌条件下去小鼠脾脏细胞密度为1x107个/ml，将脾细胞悬液加入96孔细胞培养板，每孔100μL，再加入ConA（5mg•L-1）的培养液100μL，置37℃5%CO2培养68h，然后以MTT法测定测各孔A（450nm），按下式计算刺激指数。
刺激指数=实验组A/对照组A
2.6 安全性实验 小鼠 （昆明鼠）随机分2组每组20只小鼠，一组给药，一组作为对照。给药组灌胃给药，每次给药量相当于8g•kg-1（体重），每天给药2次，连续2周。对照组给以相应的生理盐水。给药后观察即时反应，记录2周内小鼠的体重情况。
3结果
3.1 蟾蜕对小鼠体内接种的S180肉瘤、H22肉瘤、 lewis肺癌的抑制作用 蟾蜕低中高剂量对小鼠体内接种的S180肉瘤、H22肉瘤、lewis肺癌均有明显的抑制作用，与对照组有统计学差异（表12）
表1 蟾蜕对小鼠S180肉瘤， H22肝癌抑制作用（ –±s）
组别 剂量 动物数
S180 H22
/ g•kg-1 （始/终）
瘤重/g 抑制率/% 瘤重/g 抑制率/%
蟾蜕 8 10/10 1.34±0.05 53.94 1.48±0.18 43.73
4 10/10 1.60±0.19 45.02 1.81±0.26 31.18
2 10/10 1.89±0.19 35.05 1.89±0.28 28.14
环磷酰胺 0.03 10/10 0.26±0.12 91.07 0.31±0.14 88.21
对照 20/20 2.91±0.37 2.63±0.27
注；与对照组相比p<0.01(表2~5同)
表2 蟾蜕对小鼠Lewis肺癌实体的抑制作用（ –±s）
组别 剂量 动物数 瘤重 抑制率
/ g•kg-1 （始/终） /g /%
蟾蜕 8 10/10 0.376±0.05 55.40
4 10/10 0.468±0.05 44.48
2 10/10 0.547±0.05 35.11
云芝多糖 2 10/10 0.447±0.04 46.98
环磷酰胺 0.03 10/10 0.020±0.01 97.63
对照 20/20 0.843±0.10
3.2 蟾蜕对小鼠HCA肝腹水癌的影响 蟾蜕能在一定程度上延长HCA肝腹水癌小鼠的寿命，但对与对照组相比无统计学意义（表3）
表3 蟾蜕对小鼠HCA肝腹水癌的影响（ –±s）
组别 剂量 动物数 平均 延长生命率
/ g•kg-1 （始/终） /g /%
蟾蜕 8 10/ 0 17.0±2.94 15.65
4 10/ 0 17.7±2.71 20.41
2 10/0 17.6±2.50 19.73
丝裂霉素 0.002 10/4 27.0±4.30 83.67
对照 20/0 14.7±1.40
3.3 蟾蜕对荷瘤小鼠NK细胞活性的影响 蟾蜕能明显提高荷瘤小鼠NK细胞活性，与对照组相比有统计学差异（表4）
表4 蟾蜕对荷 lewis肺癌小鼠NK细胞活性影响（ –±s ，=6）
组别 剂量 实验组 效应细胞 细胞毒活性
/ g•kg-1 A A /%
蟾蜕 8 0.488±0.03 0.100±0.00 49.41
4 0.507±0.08 0.107±0.02 47.85
2 0.493±0.06 0.100±0.01 49.41
云芝多糖 2 0.455±0.04 0.113±0.015 55.41
对照 0.603±0.03 0.110±0.01 28.29
注；对照组n=12（表5同）。
3.3 蟾蜕对荷瘤小鼠T淋巴细胞转化率的影响蟾衣能明显提高荷=瘤小鼠T淋巴细胞转化率，与对照组相比有统计学差异（表5）。
表5 蟾蜕对荷lewis肺癌小鼠淋巴细胞增殖活性影响（ –±s ，n=6）
组别 剂量/ g•kg-1 A 刺激指数
蟾蜕 8 0.813±0.08 1.33
4 0.845±0.05 1.39
2 0.823±0.07 1.35
云芝多糖 2 0.855±0.05 1.45
对照 0.610±0.07
3.5 蟾蜕小鼠急性毒理实验 实验中在规定剂量范围内每天2次灌胃给药后，动物均未出现明显的不良反应，各组无死亡。灌药结束后小鼠体重均有明显增加，而给药组和对照组之间体重无明显差异，解剖小鼠各脏器均未有异常（表6）,。
表6 蟾蜕灌胃给药实验动物体重变化（ –±s ，n=10）
剂量 开始 结束
分组 性别 g•kg-1•d-1 /g /g
蟾蜕 雄 16 19.7±0.7 25.1±0.7
雌 16 20.6±0.7 24.6±0.8
对照 雄 -- 20.0±0.7 25.4±0.9
雌 -- 20.05±0.7 24.3±0.9
4 讨论
中华大蟾蜍药用价值早于梁代陶弘景所著《名医别录》就有记载。目前蟾蜍及其各部位，尤其是蟾酥和蟾皮几经称为中医临床各科的常用药，广泛用于抗肿瘤、镇痛、利水消肿、增强机体免疫力等。因此蟾蜕做为一种新发现的蟾蜍药用部位其潜在的药用价值值得研究。
本研究的动物实验表明，蟾蜕对小鼠体内接种的不同类型肿瘤（S180肉瘤、H22肝癌、Lewis肺癌，HCA肝腹水癌）均有一定的抑制作用。虽然蟾蜕的抑制肿瘤效果不如西药组（环磷酸铵、丝裂霉素），但后者常常由于毒副作用较大，临床上病人无法耐受而终止治疗。而本研究中小鼠急性毒理实验显示蟾蜕是一种比较安全的天然药物，在一定时间内大剂量服用并不会对动物造成损害。在本实验中无一例死亡，而本研究给药量几乎达到小鼠每日最大可灌胃容量的极限，因此无法测出半数致死剂量LD50。且实验结束时小鼠体重均有明显增加，毛发光亮，生长状态极佳。上述结果亦与蟾蜕的初步临床应用资料相印证。临床资料显示蟾蜕对人无明显的毒副反应，病人长期服用未见明显的消化反应。亦未发现因用此药而出现血常规、肾功能、肝功能及转氨酶异常。
目前认为，在机体抗肿瘤机制中，免疫系统的作用，尤其是细胞免疫极为重要。参与抗肿瘤细胞免疫的效应细胞主要有T细胞、NK细胞等。前者主要介导特异的杀瘤作用，通过识别肿瘤细胞便面的特异抗原来发挥杀灭作用，而后者则介导非特异的杀瘤作用，既不依赖于肿瘤抗原的自然杀伤过程，因此NK细胞发挥作用先于T细胞，被视为抗肿瘤早期免疫中的第一道防线。本研究实验数据提示，蟾蜕即可以有效增加T淋巴细胞转化率，也可以明显提高荷瘤小鼠NK 细胞活性，说明蟾蜕可以通过调节不同免疫细胞在不同环节来促进抗肿瘤免疫功能的发挥，这可能是其治疗肿瘤有效，而副作用相对较小的原因之一。由于蟾蜕的获取无需杀死蟾蜍，不会造成蟾蜍资源的破坏。因此，综合来看蟾蜕做为一种潜在的可用于抗肿瘤治疗的药物新资源，值得进一步研究。
[参考文献]
[1] 中国药用动物志协作组. 中国药用动物杂志. 第2册[M]
天津；天津科学技术出版社，1983；274
[2] 繆珠雷，张康，柏巧明，等.中华大蟾蜍新药用部位-------蟾蜕的来源、性状观察及本草考证[J].时珍国医国药，2006,17（11）2323.
[3] 梁光裕。蟾蜕治疗恶性肿瘤临床研究初探[J].中国医学研究与临床，20053（4）；24
[4] 陈建伟，李祥，许金，等.中药新资源蟾蜕抗HVI做的实验研究[J].美中医学，2007,6（6）；20
[5] 陶弘景. 名医别录[M].北京；人民出版社，1986；286.
[6] 国家中药管理局中华本草编委会.中华本草.第9分册[M].上海科学技术出版社，2000,365